در حال حاضر با توجه به اینکه محصولات متنوعی در بازار هدف می باشد ولی همچنان بیشترین محافظت و اثر بخشی واکسن های طیور که به صورت آشامیدنی مصرف می شوند در زمان استفاده از شیرخشک اسکیم می باشد (Singh, 2010 ; Tariq et al, 2018; Barbour et al, 2002). که دلیل آن وجود درصد  بالای لاکتوز( 50%) در شیر خشک اسکیم و تنوع بالای انواع اسید های آمینه (34%) می باشد. (Woodward and Tudor,1975) تائید کردند محتوی پروتئین زیاد شیر خشک اسکیم در شرایط pH خنثی دلیل اثربخشی و محافظت بهتر ویروس واکسن است. خصوصاً در روش واکسیناسیون آشامیدنی واکسنهای بروشیت و نیوکاسل (Gentry and Braune,1972),  اما متاسفانه به دلیل حلالیت پایین شیر خشک خصوصاً در آب سرد، و رسوب و تشکیل محیط کشت ثانویه برای میکروارگانسیم ها که نتیجتاً سبب تشکیل بایوفیلم و گرفتگی در خطوط آبرسانی می شود، امروزه جایگزین ها با نام تثبیت کننده های واکسن به بازار ارائه شده اند که تا حد زیادی بتوانند عامل عفونی را با حداقل شکست واکسیناسیون به طیور هدف برسانند.

با توجه به اینکه رعایت زنجیره سرد از زمان تولید، نگهداری و کاربرد واکسنها اهمیت ویژه ایی در اثر بخشی آنها دارد لذا افزایش و نوسانات دمایی خارج از زنجیره سرد ساختار کپسید بومی را تغییر می دهد و ویروس را غیر عفونی می کند، هرچند اسید ریبونوکلئیک دست نخورده باقی بماند. لذا تثبیت‌کننده‌ها معمولاً از اجزای پروتئینی (مانند پپتیدها، اسیدهای آمینه) یا قندها غیر الکلی و الکلی ( مانند ساکارز، ترهالوز، سوربیتول، مانیتول و لاکتوز) تشکیل شده‌اند که نقش ترمواستابیلیتی را ایفا میکنند و از احتمال تخریب ساختار و دناتوره شدن عامل عفونی بر اثر افزایش و نوسانات دما جلوگیری می نمایند. (Abdelaziz et al,2024; Barbour et al,2002; Kang et al,2010).

وجود اسید های آمینه دارای حداقل دو گروه آمین یا ایمین در ساختارشان توانایی محافظت ویروس واکسن را در برابر افزایش دما بالا می برد و نیز دو اسید آمینه ( لیزین، آرژنین) ممکن است به دلیل برهمکنش های الکترواستاتیکی گروه های آمینه پشت سر هم با بار مثبت با باقیمانده های دارای بار منفی روی کپسید ویروسی که منجر به اتصالات عرضی غیرکووالانسی می شود، ثبات ساختاری ویروس را افزایش می دهد. ( Dorval et al,1990; US.Pat.No 5618539) همچنین اسید آمینه لیزین هیدروکلراید در افزایش پاسخ ایمنی واکسیناسیون از مکانیسم افزایش تکثیر سلولی و تشکیل پل غیر اختصاصی بین آنتی ژن و T سل ها و گسترش کلونال نقش دارد (Dasgupta et al, 2003).

با توجه به مطالب ذکر شده و اثر بخشی بهتر شیر خشک اسکیم در نقش تثبیت کنندگی با لحاظ نمودن مقدار لیزین (آمینو اسید دی آمینه) در دوز مورد استفاده شیر خشک در زمان واکسیناسیون آشامیدنی و طبق آنالیز آن، به همان میزان در فرمول محصول پی دی فارم در کنار سایر ترکیبات استفاده شده است.

ارزیابی مقایسه ایی تاثیر 3 محصول پایدارکننده واکسن

حذف ترکیبات اکسیده کننده:

در میان بسیاری از چالش‌هایی که در طول فرآیند واکسیناسیون ایجاد می‌شود، یکی از آنها برجسته است، وجود ترکیبات اکسید کننده مانند کلر می باشد، این ترکیبات می‌توانند بر روی واکسن‌ها اثر مخربی بگذارند و آن‌ها را بی‌اثر کرده یا قدرت آن‌ها را کاهش دهند. از این رو، خنثی سازی ترکیبات اکسید کننده در واکسیناسیون طیور از اهمیت بالایی برخوردار است.

در یک ارزیابی مقایسه ای در آزمایشگاه با استفاده از اسپکتروفتومتر، ظرفیت و توانایی سه تثبیت کننده واکسن طیور در خنثی کردن ترکیبات اکسید کننده، به ویژه کلر طبق دستورالعمل مصرف مورد آزمایش قرار گرفتند.

After 120 min
mg/l
After 5 min
mg/l
Chlorine Free
(DPD Method)

5.18
5.06
Control (5ppm Chlorine free) 
0.09
0.38
Skim milk Powder (200gr/100l) + 5ppm chlorine free 
0.15
0.34
Cevamune (20gr/100l) + 5ppm chlorine   free
0.00
0.21
PdFarm   (15gr/100l) + 5ppm chlorine free

نتایج ارزیابی

نتایج ارزیابی مقایسه ای، درجات مختلفی از ظرفیت خنثی کننده تثبیت کننده ها نسبت به کلر را نشان دادند. محصولی با بالاترین ظرفیت خنثی‌سازی، انتخابی ارجح برای تثبیت واکسن خواهد بود، زیرا می‌تواند به طور موثر با اثرات منفی کلر مقابله کند. این ارزیابی مقایسه ای دیدگاه موثرتری را برای انتخاب مناسب ترین تثبیت کننده برای واکسیناسیون موثر طیور ارائه می دهد. ذکر این نکته لازم است که در فرمولاسیون محصول پی-دی فارم جهت خنثی سازی حداکثر 10ppm در صورت وجود هر یک از اکسیده کننده ها لحاظ شده است.

حلالیت و طیف استفاده:

محصول پودر گرانولی پی دی فارم نسبت به سایر تثبیت کننده ها که به صورت قرص یا پودرجوشان و با انحلال آهسته هستند، با قدرت حلالیت بالا در عرض کمتر از یک دقیقه می باشد و بنابراین زمان آماده سازی واکسن سریعتری ارائه می دهد. درمقابل سایر محصولات تجاری با خاصیت جوشان اغلب با هشدار 10 الی 15 دقیقه صبر کردن پس از حلالیت جهت اضافه کردن واکسن هستند تا محلول استوک آماده شده برای واکسن بی خطر باشد. و از طرفی شیر خشک اصولا با حلالیت پایین بخصوص در آب سرد، گرفتگی خطوط آبرسانی، ایجاد محیط کشت ثانویه برای میکروارگانیسم ها با تشکیل بیوفیلم همراه است. 


شکل: پودر گرانولی
رنگ: آبی
حلالیت: 100% در آب
چگالی خاص: 810 kg/m3
pH: 7.3
درصد ماده موثره: 14-17 %

تعدیل pH:

وجود یک سیستم بافر مناسب در یک تثبیت کننده واکسن یک ضرورت مهم در تعدیل pH  آب است که بتواند قدرت زنده مانی واکسن را در انواع آب اسیدی و قلیایی تا حد مطلوب حفظ نماید و با گذشت زمان از عفونت زایی واکسن کاسته نشود. محصول پی-دی فارم دارای 2 سیستم بافری سینرژیک می باشد که توانایی تعدیل pH 6 و pH 9 در بازه 6.5-7.7 است. در یک آزمایش انجام شده با تهیه محلول های استوک قلیایی ( با کمک: سدیم هیپوکلریت) و اسیدی ( با کمک: اسید هیدروکلریک ) قدرت تعدیلpH سه تثبیت کننده مقایسه شد.

Alkaline Water
Acidic Water
Stock Solution
120min
5min
120min
5min
pH   adjustment period
8.19
8.21
6.07
6.04
Control
7.83
7.96
6.63
6.51
Skim Milk Powder
8.09
8.11
6.18
5.97
Cevamune
7.45
7.69
6.93
6.64
PdFarm

نتایج ارزیابی:

طبق آزمایش انجام شده پی دی فارم تعدیل pH مناسب تری نشان می دهد و آن بخاطر وجود  دو سیستم بافری متفاوت آن است که بدون داشتن خاصیت جوشان است. نتایج مطالعه (Tariq et al, 2018) نشان می دهد که ایده آل ترین محدوده مناسب برای واکسن بین pH 7 الی 8 می باشد و بیان کردند که در pH های به شدت اسیدی (5) و قلیایی (9) برای عفونت زایی ویروس واکسن مضر است و نیز ( Sturman et al, 1990) بیان کردند در pH های پایین، پوشش ویروس ها تغییرات ساختاری در گلیکوپروتئین های خود نشان می دهند که توانایی آنها را برای اتصال به گیرنده های سطحی سلول مخدوش می کند.


عیار آنتی بادی و عملکرد سیستم ایمنی :

در آزمایشی تعداد 300 قطعه جوجه یک روزه ی گوشتی سویه راس 308، در قالب طرح کاملا تصادفی با 4 تیمار، 5 تکرار و 15 قطعه جوجه در هر تکرار تا سن 42 روزگی با شرایط کاملا یکسان از نظر مدیریتی، تغذیه، تهویه، نوردهی و برنامه واکسیناسیون در فارم آزمایشی دانشکده کشاورزی دانشگاه گیلان پرورش یافتند تیمارها به صورت زیر علیه بیماری نیوکاسل در سن 9 و 23 روزگی در دمای محیطی 28 درجه سانتی گراد به روش آشامیدنی واکسینه شدند . (پایان نامه کارشناسی ارشد)

1- گروه شاهد: واکسن کلون سویه Clone.12IR رازی بدون افزودن تثبیت کننده

2- واکسن کلون سویه Clone.12IR + تثبیت کننده شیر خشک بدون چربی (200 گرم/ 100 لیتر آب)

3- واکسن کلون سویه Clone.12IR + تثبیت کننده سوامیون ( 20 گرم/ 100 لیتر آب)

4- واکسن کلون سویه Clone.12IR + تثبیت کننده پی دی فارم ( 15 گرم/ 100 لیتر آب)

یک هفته پس از واکسیناسیون و نهایتاً در سن 35 روزگی یک سی سی نمونه خون از 3 جوجه از هر تکرار جهت جداسازی سرم و آزمون تعیین تیتر آنتی بادی به روش HI انجام شد. همچنین جهت تعیین عملکرد سیستم ایمنی (نسبت هتروفیل به لنفوسیت) و تعیین فراسنجه­ های خونی از 3 جوجه از هر تکرار یک سی سی نمونه خون در لوله های حاوی ضد انعقاد خونگیری و به آزمایشگاه ارسال شد.

نتایج ارزیابی:

اثر استفاده از انواع تثبیت کننده­های واکسن در آب آشامیدنی بر عیار آنتی­بادی علیه واکسن نیوکاسل

Treatment
15 Day
35 Day
Control
b2.26
b3.36
Skim M
a3.66
a5.30
Cevamune
a3.40
a5.30
PdFarm
a3.40
a5.64
SEM
0.390
0.242
P-Value
0.001
0.001

حروف متفاوت در هر ردیف نشان دهنده تفاوت معنی­ دار است ( P< 0.05)

مقایسه میانگین عیار  بدست آمده از تیمارهای مورد بررسی، اختلاف معنی دار گروه کنترل را  با دیگر تیمارها در هر دو مرحله نمونه گیری در 15 و 35 روزگی جوجه های گوشتی نشان داد، به طوری که تمام تیمارهای آزمایشی عیار بالاتری نسبت  گروه شاهد داشتند (05/0>p). لازم به ذکر است عیار آنتی بادی علیه واکسن نیوکاسل همه تیمارها در 35 روزگی نسبت به 15 روزگی افزایش پیدا کرده است و عیار آنتی بادی بین تثبیت کننده ها تحت بررسی اختلاف معنا داری مشاهده نشد.

مقایسه میانگین پارامترهای خونی روز 15

H/L
E%
H%
L%
M %
HCT %
RBC *
106
WBC
Treatment
ab0.46
a3.20
b28.60
c62.60
a5.53
28.28
2.20
23533
Control
c0.31
c0.46
c23.13
a73.46
b2.60
28.34
2.17
22333
Skim.M
a0.49
c0.60
a32.20
bc65.33
b1.80
27.89
2.18
23267
Cevamune
b0.43
b1.20
b28.53
b67.73
b2.53
29.05
2.23
22867
PdFarm
0.018
0.259
0.841
1.019
0.375
0.277
0.023
447.21
SEM
0.0001
0.0001
0.0001
0.0001
0.0001
0.551
0.783
0.822
P-Value

حروف متفاوت در هر ردیف نشان دهنده تفاوت معنی­ دار است ( P< 0.05)

مقایسه میانگین پارامترهای خونی روز 35

H/L
E%
H%
L%
M %
HCT %
RBC *
106
WBC
Treatment
a0.31
0.60
a23.00
b74.30
2.20
28.58
2.17
23900
Control
b0.23
1.30
b18.00
a78.50
2.20
27.67
2.06
20700
Skim.M
b0.27
1.40
b20.20
a76.20
2.10
28.65
2.17
23800
Cevamune
ab0.21
1.20
b17.40
ab79.70
1.70
27.12
2.03
25700
PdFarm
0.012
0.198
0.661
0.748
0.157
0.295
0.025
867.90
SEM
0.015
0.514
0.002
0.034
0.670
0.196
0.116
0.238
P-Value

حروف متفاوت در هر ردیف نشان دهنده تفاوت معنی­ دار است ( P< 0.05)

مقایسه میانگین گلبول­های سفید، قرمز و هماتوکریت در تیمار­های مورد پژوهش در سنین 15 و 35 روزگی جوجه­ ها اختلاف معناداری نشان نداد (P<0.05). اما در میزان لنفوسیت ها در تولید پادتن اختلاف معنا دار بین تیمارها مشاهده شد. در چندین مطالعه انجام یافته توسط محققین نتیجه گرفته شده که عوامل تنش زا من جمله استرس گرمایی باعث افزایش نسبت هتروفیل به لنفوسیت می شود (Cravener et al, 1992; Beuving et al, 1989; Hacking et al, 1993). در مطالعه حاضر نسبت هتروفیل به لنفوسیت در تیمارهای مختلف اختلاف معنادار نشان می دهد که دلیل آن را می توان به وجود اسید های آمینه در کاهش استرس گرمایی در نتیجه پاسخ سریعتر به دنبال تکثیر سلولی بیشتر نسبت داد (Ajakaiye et al, 2010; Droval et al, 1990; Dasgupta et al,2003). در هر دو محصول شیر خشک اسکیم و پی دی فارم منبع آمینو اسید لیزین به میزان برابر موجود است.

اثر بخشی پی دی فارم بر اساس TDS و بررسی آلودگی میکروبی:

در آزمون انجام شده توسط دکتر قلیانچی لنگرودی استادیار و متخصص ویروس شناسی دانشکده دامپزشکی تهران، واکسن نیوکاسل و سرم واکسن سازی رازی  در آب دارای TDS  حدود 600 ، به تنهایی و همراه  محصول پی-دی فارم  آماده سازی گردید. میزان EID50  در یک دوز واکسن  یک و نیم ساعت بعد از آماده سازی در دمای 28Co مورد ارزیابی قرار گرفت. این کار در سه تکرار صورت پذیرفت. میزان بررسی دوز عفونی بر اساس روش ارزیابی EID50 در تخم مرغ SPF صورت پذیرفت.

نتایج ارزیابی:

نتیجه  نشان داد در گروهی که حلال واکسن پی-دی فارم استفاده گردیده بود میزان EID50 واکسن برابر 4.70E+06  بوده که اختلاف معنی داری با گروه  کنترل (7.32E+05)  که از این ماده استفاده نشده بود داشت. نتیجه این آزمایش نشان دهنده موثر بودن  در آب دارای سختی بالا در حفظ  ویروس واکسن  در شرایط شبیه ساز شده می باشد. (نمودار و جدول شماره یک)

نمودار شماره 1 : میزان EID50  در دو گروه کنترل و تیمار شده با پی-دی فارم


جدول شماره 1 : میزان EID50  واکسن نیوکاسل لاسوتا در دو گروه کنترل و تیمار شده با PDFARM

بررسی آلودگی میکروبی :

جهت اثبات ادعای آنالیز میکروبی  طبق دستور العمل میکروبی استاندارد آلودگی توتال کانت ، Ecoli  و سالمونلا و همچنین PCR مایکوپلاسما انجام گردید.

نتایج بررسی میکروبی به شرح ذیل  (جدول شماره 2) است و هیچ گونه مشکل میکروبی مشاهده نشد. 

Ref
Result
Range
Unit
Item
ISIRI 11166
<3
<3
MPN
Coliform count
ISIRI 2946
<3
<3
MPN
E.coli
ISIRI 1810
منفی
منفی
25gr/
Salmonella
(PCR) USP 42
فاقد آلودگی
Mycoplasma

جدول شماره  2: آنالیز میکروبی و مایکوپلاسمایی محصول PDFARM

پی-دی فارم یک محصول کاملا ایرانی با فرمولاسیون انحصاری متفاوت از محصولات مشابه داخلی و خارجی است که بر اساس کیفیت آب در شرایط اقلیمی متفاوت برای واکسیناسیون آشامیدنی و اسپری طراحی شده است تا حداکثر موفقیت در واکسیناسیون و اثربخشی واکسن های مورد استفاده در طیور را فراهم کند. پخش سراسری این محصول توسط شرکت صنایع مرغ مادر ایران انجام میشود.